Vielen Dank für Ihren Besuch auf nature.com.Sie verwenden eine Browserversion mit eingeschränkter CSS-Unterstützung.Um die beste Erfahrung zu erzielen, empfehlen wir Ihnen, einen aktuelleren Browser zu verwenden (oder den Kompatibilitätsmodus im Internet Explorer zu deaktivieren).In der Zwischenzeit zeigen wir die Website ohne Stile und JavaScript an, um eine kontinuierliche Unterstützung zu gewährleisten.Scientific Reports Band 6, Artikelnummer: 19800 (2016 ) Diesen Artikel zitieren[D]-H6L9, als ein pH-responsives antimikrobielles Peptid (AMP), wurde von uns als eine ausgezeichnete Wahl bei der Tumor-Mikroumgebung-responsiven Abgabe erwiesen, da es Liposomen reaktionsfähig auf die angesäuerte Tumor-Mikroumgebung machen könnte.[D]-H6L9-modifizierte Liposomen konnten jedoch nicht aktiv auf den Tumorbereich zielen.Daher wurde das auf Integrin αvβ3 gerichtete Peptid RGD zusammen mit [D]-H6L9 auf Liposomen [(R + D)-Lip] modifiziert, um die Effizienz der Tumorabgabe zu verbessern.Unter pH 6,3 konnte (R + D)-Lip von C26-Zellen und C26-Tumor-Sphäroiden (Integrin αvβ3-positiv) mit signifikant verbesserter Effizienz im Vergleich zu anderen Gruppen aufgenommen werden, was sowohl von RGD als auch von [D]-H6L9 beigetragen wurde. während RGD die zelluläre Aufnahmeleistung auf MCF-7-Zellen (Integrin αvβ3-negativ) nicht erhöhte.Die Ergebnisse zeigten, dass RGD die zelluläre Aufnahme von (R + D)-Lip verringern könnte, während [D]-H6L9 sie erhöhen könnte, was die Rolle von sowohl RGD als auch [D]-H6L9 bei der zellulären Internalisierung von (R + D)-Lip impliziert.Andererseits könnte (R + D)-Lip dem Einschluss von Lysosomen entkommen.PTX-beladenes (R + D)-Lip könnte die zelluläre Toxizität gegenüber C26-Zellen im Vergleich zu nur mit RGD bzw. [D]-H6L9 modifizierten Liposomen weiter erhöhen und eine bemerkenswerte tumorhemmende Wirkung auf C26-Tumormodelle erzielen.Ein erniedrigter extrazellulärer pH-Wert wurde als eine der wichtigsten Heterogenitäten von Tumoren hervorgehoben, die durch die Hypoxie und den abnormalen Stoffwechselprozess des Tumors ausgelöst wurde und zur Ansäuerung der extrazellulären Umgebung des Tumors führte1,2,3.Diese einzigartige Eigenschaft von Tumoren könnte genutzt werden, um pH-responsive Plattformen zu entwickeln.Darunter haben auf Histidin basierende Arzneimittelverabreichungssysteme beträchtliche Aufmerksamkeit erhalten4,5,6,7.Mit einem pKa-Wert von etwa 6,5 ​​verleiht der Imidazolring an Hisitidin die Fähigkeit, Histidin Protonen zu spenden oder an Histidin zu empfangen3, was bedeutet, dass es in einer sauren Tumormikroumgebung in einen positiv geladenen Zustand protonieren könnte, aber in Geweben mit normalem physiologischen Zustand leicht negativ geladen bleiben könnte.Auf diese Weise wurden Histidin-reiche zellpenetrierende oder membranlytische Peptide entwickelt8,9,10,11,12,13,14 und ihr unterschiedsloses und starkes Eindringen in normales Gewebe konnte abgeschwächt werden;während in einer angesäuerten Umgebung, wie Tumoren, ihre Membranpermeationsfähigkeit und andere Aktivität wiederhergestellt werden könnten.pH-reaktive Peptide könnten auch an Nanoträgern verankert werden, was Nanoträgern ebenfalls eine pH-Reaktionsfähigkeit verleiht13,14,15,16,17.In unserer früheren Arbeit16,17 haben wir bereits ein pH-responsives antimikrobielles Peptid (AMP) [D]-H6L9-vermitteltes PEGyliertes Liposom (D-Lip) konstruiert16,17, das sowohl in vitro als auch in vivo Kompetenz bei der Tumorzellabgabe zeigte.Obwohl Nanocarrier dieser Art von Tumorzellen in angesäuerter Umgebung effizienter internalisiert werden konnten, wurde dies nur durch die passive Akkumulation von Oberflächen-PEGylierten Nanocarriern (Liposomen oder polymeren Micellen) durch EPR-Effekt realisiert, da diese Peptide kein Tumor waren -Homing-Peptide mit Targeting-Kapazität.Daher war die Einführung geeigneter Liganden erforderlich, die Tumore spezifisch erkennen können.Neben der Ansäuerung durch aerobe Glykolyse in Tumoren war die Angiogenese ein weiteres wichtiges Kennzeichen von Krebsarten, die in soliden Tumoren allgegenwärtig waren und eine wichtige Rolle bei Tumorwachstum und Metastasierung spielten18,19.Integrin αvβ3 werden universell in einer Vielzahl von Tumoren exprimiert und könnten als tumorspezifische Rezeptoren angesehen werden, die von zirkulierenden Liganden20, einschließlich zyklischem RGD21, angegriffen werden könnten.Als ausgezeichnete Tumor-Targeting-Einheit könnten RGD oder RGD-verankerte Nanoträger effizient auf Tumore abzielen22,23,24.Es könnte mit anderen Liganden oder zelldurchdringenden Peptiden für eine verstärkte tumorgerichtete Abgabe in multifunktionalen Nanoträgern kombiniert werden25,26,27,28,29,30,31.Zusammen mit zelldurchdringenden Peptiden wie TAT konnte eine verbesserte photodynamische Therapie von Hela-Zellen und Hela-Tumor-tragenden Mäusen erworben werden27.Als TAT ​​und RGD auf Silica-Nanopartikeln co-modifiziert und zur Tumortherapie eingesetzt wurden, konnte das Tumorwachstum bei Mäusen erfolgreich unterdrückt werden28.Allerdings könnte TAT als ein typisches zelldurchdringendes Peptid und ohne Abschirmung durch eine hydrophile Schutzschicht wie PEG direkt mit Blutseren interagieren, was seine pharmakokinetischen Profile verändert und seine in vivo-Anwendung gefährdet.In dieser Arbeit konstruierten wir ein dual-funktionelles Liposom [gespendet als (R + D)-Lip], das mit einem pH-responsiven antimikrobiellen Peptid [D]-H6L9 und einem spezifischen Liganden RGD für die Tumorabgabe co-dekoriert wurde .Bevor es Tumore erreichte, wurde das histidinreiche Peptid [D]-H6L9 im Blutkreislauf und in normalen Geweben (pH 7,4) inaktiviert.Bei der Ankunft an Tumoren könnte RGD als Targeting-Ligand Tumorzellen (C26-Zellen) identifizieren, die überhaupt Integrin-αvβ3-Rezeptoren exprimieren.Dann könnte die Zellpermeation von [D]-H6L9 in der angesäuerten Tumorumgebung (pH 6,3) potenziert werden, wodurch die tumorspezifische Abgabe von Liposomen und ihrer Fracht gesteigert wird.(Abb. 1)Schematische Darstellung der (R + D)-Lip.(A) Die Struktur von (R + D)-Lip und seine Oberflächenladungsvariation bei unterschiedlichen pH-Werten.(B) Innerhalb von Tumoren konnte das RGD-Peptid Intergin αVβ3 erkennen, das auf Tumorzellen stark exprimiert wurde, und [D]-H6L9 mit aktivierter Zellpenetrationskapazität in der Tumormikroumgebung könnte helfen, (R + D)-Lip intrazellulär zu transportieren.Dieser Prozess wurde sowohl von RGD als auch von [D]-H6L9 beigesteuert, und (R + D)-Lip konnte mit Hilfe des pH-responsiven Peptids [D]-H6L9 dem Einschluss von Endo/Lysosomen entkommen.Liposomen wurden mit dem Filmdispersionsverfahren hergestellt.Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, lagen die Größen der Liposomen alle im Bereich von 115 nm bis 140 nm, ob unter pH 7,4 oder pH 6,3, was für eine in vivo-Tumorzuführung geeignet war.TEM-Bild und Größenverteilung der PTX-beladenen (R + D)-Lippe wurden auch in Abb. S1 angezeigt.Die Einschlusseffizienz von PTX durch verschiedene Liposomen erreichte alle über 90 % und die Beladungskapazität betrug 2,75 % (w/w) für (R + D)-Lip.Die Serumstabilität von Liposomen konnte ebenfalls validiert werden (Abb. 2), wobei sich die Durchlässigkeit über 24 h kaum veränderte, was anzeigt, dass keine Aggregation im Serum gebildet wurde, die auf die PEGylierung von Liposomen zurückzuführen war.Das faszinierendste Phänomen dürfte die Umwandlung der Zeta-Potentiale von [D]-H6L9-verankerten Liposomen [einschließlich D-Lip und (R + D)-Lip] von negativ zu positiv sein, wenn der pH-Wert von 7,4 (normale Gewebeumgebung) gesenkt wurde -Nachahmung) bis 6,3 (Tumor-Mikroumgebung-Nachahmung) (Tabelle 1).Dies war auf die Protonierung von Histidinen im Peptid [D]-H6L9 zurückzuführen, was bereits durch unsere früheren Arbeiten nachgewiesen wurde16,17.Es war ersichtlich, dass (R + D)-Lip auch Ladungsumkehrkapazität zeigte (Tabelle 1), was zeigt, dass die Zugabe von RGD auf die Liposomenoberfläche die pH-Reaktionsfähigkeit des Peptids [D]-H6L9 nicht beeinflusste.(A), dargestellt durch Transmission) und Partikelgrößen (B) von Liposomen in 50 % FBS in PBS für 24 h unter 37 °C.(n = 3, Mittelwert ± SD)Der Western-Blot-Assay wurde durchgeführt, um das Expressionsniveau von Integrin αv und Integrin β3 auf C26- und MCF-7-Zellen zu quantifizieren (Abb. S2).Gemäß den Ergebnissen wurde C26 als repräsentative αvβ3-Integrinrezeptor-positive Tumorzelle ausgewählt und MCF-7 war der Repräsentant der αvβ3-Integrinrezeptor-negativen Tumorzellen32,33,34.Auf C26-Zellen war die zelluläre Aufnahme von R-Lip 1,42-fach und 1,45-fach im Vergleich zu PEG-Lip unter pH 7,4 bzw. pH 6,3, was zeigt, dass die Einführung von RGD die zelluläre Aufnahmeeffizienz von Liposomen durch αvβ3-positiven Tumor erleichterte Zellen (Abb. 3A).Im Gegensatz dazu fand diese bevorzugte Aufnahme von R-Lip gegenüber PEG-Lip bei MCF-7-Zellen nicht statt (Fig. 3B).D-Lip zeigte sowohl bei C26-Zellen (3,07-fache Steigerung unter pH 6,3 im Vergleich zu pH 7,4) als auch bei MCF-7-Zellen (4,49-fache Steigerung unter pH 6,3 im Vergleich zu pH 7,4) ein pH-responsives zelluläres Aufnahmeprofil.In ähnlicher Weise zeigte (R + D)-Lip auf beiden Zellen eine pH-Reaktionsfähigkeit, wenn auch in unterschiedlichem Maße: Auf C26-Zellen stieg die zelluläre Aufnahmeeffizienz um das 4,25-fache unter pH 6,3 im Vergleich zu pH 7,4, was zeigt, dass die zelluläre Aufnahme von (R + D)-Lip durch αvβ3-positive Tumorzellen, wie C26, wurde sowohl von RGD als auch von [D]-H6L9 vermittelt.Im Gegensatz dazu erhöhte RGD die zelluläre Aufnahme von (R + D)-Lip durch MCF-7-Zellen unter pH 6,3 im Vergleich zu D-Lip nicht.Was die Zytotoxizität von PTX-beladenen Liposomen betrifft, die durch den MTT-Assay bewertet wurde, konnte auch geschlussfolgert werden, dass die Zytotoxizität von PTX-beladenen (R + D)-Lip auf C26-Zellen unter pH 6,3 auf die Kombination von RGD und [D] zurückzuführen war. -H6L9 (Fig. 3C), während auf MCF-7-Zellen das Vorhandensein von RGD auf der Oberfläche von Liposomen die Zytotoxizität von PTX-beladenen Liposomen nicht förderte (Fig. 3D).Detaillierte zelluläre Hemmraten verschiedener Liposomen können den Tabellen S1 und S2 entnommen werden.Zelluläre Aufnahme von Liposomen durch C26(A) intergin αVβ3-positive Zellen) und MCF-7 (B) intergin αVβ3-negative Zellen), bestimmt durch Durchflusszytometrie, sowie die IC50-Werte von PTX-beladenen Liposomen auf C26 (C) und MCF-7 (D) Tumor Zellen bestimmt durch MTT-Assay.** zeigt p < 0,05 an und NS zeigt keinen signifikanten Unterschied an.(n = 3, Mittelwert ± SD)Der kompetitive Hemmungsassay diente dazu, den Einfluss von überschüssigem freiem [D]-H6L9 oder RGD-Peptid auf die zelluläre Aufnahme von (R + D)-Lip zu erkennen.Nach 2 h drehte sich freies [D]-H6L9 um, um die zelluläre Aufnahme von (R + D)-Lip etwas zu fördern, während es bemerkenswert war, dass freies RGD den zellulären Endozytoseprozess stark unterdrücken konnte ( 4A ).(A) CLSM-Bilder von C26-Zellen, die mit CFPE-markiertem (R + D)-Lip in Gegenwart von freiem RGD-Peptid oder [D]-H6L9 inkubiert wurden.(B) Lysosomenfärbung, nachdem C26-Zellen mit CFPE-markiertem (R + D)-Lip für 1 oder 4 h behandelt wurden.Der Maßstabsbalken repräsentiert 20 μm.In Fig. 4B wurde gezeigt, dass CFPE-markiertes (R + D)-Lip innerhalb von 1 h größtenteils an die Zellmembran angrenzte und innerhalb der Zellperipherie verteilt war.Liposomen mit positiv geladener Oberfläche (sowohl kationische Liposomen als auch kationische CPP-vermittelte Liposomen) wurden oft innerhalb des peripheren Teils von Zellen nach einem kurzen Zeitraum der zellulären Aufnahme gefunden15,35,36.Nach 4 h konnten C26-Zellen leicht (R + D)-Lip aufnehmen.Obwohl es eine gewisse Überlappung von Lysosomen und Liposomen gab (gezeigt in der Farbe Gelb), wurde festgestellt, dass die Fluoreszenz der meisten (R + D)-Lip außerhalb der Lysosomen lag ( 4B ).Dies sollte auf das Vorhandensein von [D]-H6L9 auf den Liposomen zurückzuführen sein, wie wir in unserer früheren Arbeit nachgewiesen haben16,17, dass [D]-H6L9 enthaltende Liposomen dem Einschluss von Lysosomen entkommen oder sich diesem entziehen könnten.Ähnlich den Ergebnissen der zellulären Aufnahme in 3.2 zeigten D-Lip und (R + D)-Lip eine verbesserte Tumor-Sphäroid-Aufnahme unter pH 6,3 im Vergleich zu 7,4 ( 5 ).Bemerkenswert war, dass (R + D)-Lip unter pH 6,3 im Vergleich zu anderen Gruppen in der Lage zu sein schien, mehr in den Sphäroiden anzureichern.Dies sollte auf die kombinierte Vermittlung von [D]-H6L9 und RGD zurückgeführt werden.CLSM-Bilder, die die Aufnahme von CFPE-markierten Liposomen auf C26-Tumor-Sphäroiden nach 2 h zeigen.Aufgrund der PEGylierung auf Liposomenoberflächen konnten alle vier Gruppen von Liposomen effizient Tumore erreichen (Fig. 6).Als sich die Zeit von 4 h auf 24 h verlängerte, begannen DiR-markierte Liposomen, sich im Tumorbereich anzusammeln ( 6A ), und diese passive Ansammlung war hauptsächlich auf den EPR-Effekt zurückzuführen.Ex-vivo-Fluoreszenzbilder verschiedener Organe wurden ebenfalls aufgenommen (Abb. 7B).Es zeigte sich, dass die Verteilung von Liposomen in Herzen, Lungen und Nieren ziemlich minimal war und ihre Verteilung in Milz und Leber einander ziemlich ähnlich war.Mit RGD [einschließlich R-Lip und (R + D)-Lip] modifizierte Liposomen schienen jedoch im Vergleich zu den anderen beiden Gruppen (PEG-Lip und D-Lip) in der Lage zu sein, sich stärker im Tumorbereich anzusammeln.Die Beobachtung an den Tumor-Kryoschnitten zeigte, dass (R + D)-Lip leichter aufgenommen werden konnte als alle anderen Gruppen, was aus der Förderung sowohl von [D]-H6L9 als auch von RGD resultieren könnte (Abb. S3).(A) In-vivo-Bilder von C26-Tumor-tragenden Balb/C-Mäusen 4 oder 24 h nach Injektion von DiR-markierten Liposomen.(B) Ex-vivo-Bilder von Organen oder Tumorgeweben von C26-Tumor-tragenden Balb/C-Mäusen 24 nach Injektion von DiR-markierten Liposomen.(A) Tumorwachstumskurven von Mäusen, die verschiedene PTX-beladene Liposomen erhielten (n = 6, Mittelwert ± Standardabweichung). Schwarze Pfeile zeigen Verabreichungszeiten an.(B) Variationen des Körpergewichts verschiedener Gruppen (n = 6, Mittelwert ± Standardabweichung). Schwarze Pfeile zeigen die Zeiten der Verabreichung an.(C) Repräsentative CD133-Immunfärbung (dunkelbraun) von Tumorschnitten.(D) Quantifizierung von CD133-positiven Zellen in Tumorschnitten aus jeder Gruppe.(n = 6, Mittelwert Mittelwert ± SD).Die Bilder wurden mit ImageJ 1.47V verarbeitet.** angegeben p < 0,05.Im Vergleich zu allen anderen Gruppen konnte das dualfunktionelle Liposom (R + D)-Lip zu einer signifikanteren Unterdrückung des Tumorwachstums führen und das Körpergewicht aller Gruppen nahm während der Behandlung kaum ab, was impliziert, dass alle PTX-beladenen Liposomen wenig zeigten In-vivo-Toxizität (Fig. 7A, B).Eine hohe CD133-Expression wurde als eines der typischen Merkmale von Stammzellen angesehen, einschließlich einiger Krebsstammzellen (CSCs).Daher haben wir auch das CD133-Expressionsniveau verschiedener Tumore durch immunhistochemische Färbung bewertet.Es wurde herausgefunden, dass die CD133-positiven Zellen aus den Schnitten der (R + D)-Lip-Gruppe die wenigsten unter allen Gruppen zu sein schienen ( 7C , D).Im Laufe der jahrzehntelangen Entwicklung haben sich Nanoträger für Tumore von einfachen und inerten Arzneimittelträgern zu Arzneimittelabgabeplattformen entwickelt, die auf den Tumor abzielen oder stark auf die Tumormikroumgebung ansprechen.Daher wurde von uns [(R + D)-Lip] ein dual-funktionalisiertes liposomales Abgabesystem entwickelt, das durch RGD und pH-responsives AMP [D]-H6L9 co-modifiziert ist.Aufgrund der Anwesenheit von [D]-H6L9 konnte das Zeta-Potential von sowohl D-Lip als auch (R + D)-Lip von negativ zu positiv umgekehrt werden, wenn der pH-Wert aufgrund der Protonierung von Histidin von 7,4 auf 6,3 fiel.Dies führte wiederum zu einer signifikant verbesserten zellulären Aufnahmeeffizienz sowohl bei C26-Zellen als auch bei MCF-7-Zellen unter pH 6,3.Die Einführung von RGD verbesserte jedoch weiter die zelluläre Aufnahmeeffizienz von (R + D)-Lip auf C26-Zellen, die als die repräsentativen &agr;v&bgr;3-Integrin-Rezeptor-positiven Tumorzellen angesehen wurden.Dasselbe Phänomen wurde bei MCF-7-Zellen nicht beobachtet, bei denen die Expression des αvβ3-Integrinrezeptors negativ war32,33,34.Unterdessen könnte PTX-beladenes (R + D)-Lip die deutlichste zelluläre Zytotoxizität unter pH 6,3 auf C26-Zellen induzieren, was impliziert, dass die kombinierte Wirkung von RGD und [D]-H6L9 dazu beitragen könnte, mehr Liposomen in αvβ3-Integrin-positive Zellen zu transportieren Zellen.Multifunktionale Nanoträger könnten die Vorteile verschiedener Targeting-Liganden nutzen und eine viel effizientere gezielte Abgabe erreichen als Liposomen mit einzelnen Liganden in synergistischer oder kombinierter Weise37,38,39,40.Unter ihnen haben Nanoträger, die mit einem spezifischen Liganden und einem zellgängigen Peptid modifiziert sind, beträchtliche Aufmerksamkeit auf sich gezogen25,39,40.Der spezifische Liganden-vermittelte intrazelluläre Transport war oft nicht effizient genug, da der Rezeptor-abhängige Weg, der durch den spezifischen Liganden vermittelt wird, oft gesättigt war25, daher könnte die Zugabe von CPPs den zellulären Transport stark verbessern.[D]-H6L9, als ein zellmembrandurchlässiges Peptid, spielte in unserer Arbeit die Rolle eines pH-responsiven, zelldurchdringenden Peptids.Es wurde berichtet, dass die αvβ3-Integrinrezeptor-abhängige Endozytose Liganden-spezifisch und sättigbar war25,31, daher könnte überschüssiges RGD-Peptid den αvβ3-Rezeptor im Voraus blockieren, was zu einer verringerten Internalisierung von (R + D)-Lip führt.Wie für freies [D]-H6L9, obwohl es anscheinend keinen spezifischen Rezeptor dafür auf C26-Zellen gab, könnte ein AMP, das die Membranintegrität im membrandepolarisierenden lytischen Mechanismus stören könnte, möglicherweise die Zellmembran destabilisieren und durchdringen, wenn es in höherer Konzentration angewendet wird9 , wodurch der intrazelluläre Transport von (R + D)-Lip erleichtert wird.Rezeptor-abhängige (in unserem Fall αvβ3-Integrin-Rezeptor-abhängige) Endozytose war oft mit Endo/Lysosomen verbunden41,42, unsere Ergebnisse bewiesen jedoch, dass (R + D)-Lip das Potenzial haben, der Einschließung von Lysosomen zu entkommen.Dazu trug das Peptid [D]-H6L9 bei, das in einer Endo/Lysosomen-Umgebung eine starke Membrandestabilisierung verursachen konnte, indem Liposomen aus Endo/Lysosomen freigesetzt wurden, was für die intrazelluläre Arzneimittelabgabe von Vorteil war, wie wir zuvor bewiesen haben16.Tumor-Sphäroide waren günstige und einfache Modelle für die Evaluation einer Tumor-Chemotherapie43.Es könnte in gewisser Weise den diffusionsbasierten Transport von Nanopartikeln in einem Milieu vorhersagen, das die strukturelle und Mikroumgebungsheterogenität besser widerspiegelt, die üblicherweise mit soliden Tumoren assoziiert wird44.RGD war bekannt für seine Penetrationsfähigkeit in solide Tumore, die durch Integrin-abhängige Transzytose in tiefere Tumorprobleme vermittelt wurde45,46.Zusammen mit [D]-H6L9 schien (R + D)-Lip in der Lage zu sein, in den inneren Bereich von Tumor-Sphäroiden einzudringen.Es wurde berichtet, dass innerhalb von Tumor-Sphäroiden Hypoxiebereiche und pH-Gradienten existieren und der Kern danach weiter angesäuert werden könnte47.Daher war es theoretisch möglich, dass [D]-H6L9 im Kern mit gesenktem pH-Wert aktiviert werden konnte und (R + D)-Lip im Vergleich zu anderen Gruppen in Tumorzellen im tieferen Bereich in Tumor-Sphäroiden eindringen und dort verbleiben konnte .In dieser Arbeit schien R-Lip keine signifikante Penetration auf Sphäroide zu zeigen, wahrscheinlich weil die Aufnahme von CFPE-markierten Liposomen durch Sphäroide im Vergleich zu D-Lip und (R + D)-Lip (unter pH 6,3) auf einem niedrigeren Niveau blieb ) und die Penetrationskapazität war nicht so hervorragend wie (R + D)-Lip in einem In-vitro-Modell.Die Bioverteilung verschiedener Liposomen und ihre In-vivo-Eigenschaften sollten weiter untersucht werden.Wie unsere früheren Arbeiten zeigten, besaß [D]-H6L9 keine aktive Tumor-Homing-Kapazität16,17.Inzwischen wurde bestätigt, dass RGD als Tumor-Homing-Ligand betrachtet und beim aktiven Targeting verschiedener Tumoren für eine veränderte und verstärkte Tumorakkumulation eingesetzt werden könnte48,49,50.In vivo könnte RGD an Tumorblutgefäße oder sogar Tumorzellen binden, die den αvβ3-Integrinrezeptor überexprimieren, um ein aktives Tumor-Targeting zu realisieren25,51.Es wurde berichtet, dass das vaskuläre Targeting durch RGD-funktionalisierte Nanoträger möglich war, was zu einer schnellen und effizienten frühen Bindung an Tumorblutgefäße führte.Im Laufe der Zeit trat passives Targeting (EPR-Effekt) ein und war durch ausschließliches vaskuläres Targeting effizienter und führte im Gegenzug zu einer höheren Gesamttumorretention52.Dies war für die erhöhte Akkumulation von R-Lip und (R + D)-Lip in Tumoren verantwortlich.Dies bedeutete, dass (R + D)-Lip, das wir in dieser Arbeit konstruiert haben, deutliche Vorteile gegenüber dem D-Lip, das wir vorher konstruiert haben, besaß.Die CD133-Expression war ein sehr typisches Merkmal von Stammzellen und wurde als spezieller Marker für Krebsstammzellen (CSCs) identifiziert53.CSCs galten als resistent gegen Chemotherapie und einige Studien deuteten darauf hin, dass CSCs als Ursache für Tumormetastasen und Rückfälle angesehen wurden54.Daher wäre eine erfolgreiche Reduktion und sogar Ausrottung von Krebstumorzellen von potenzieller Bedeutung für die Tumortherapie.Die Ergebnisse aus 7C zeigten, dass die Menge an CD133-positiven CSCs aus der Gruppe (R + D)-Lip unter allen minimal war.Aus Fig. 5 konnte geschlossen werden, dass (R + D)-Lip tiefer in die Tumor-Sphäroide eindringen könnte und mehr (R + D)-Lip von Tumor-Sphäroiden aufgenommen und zurückgehalten werden könnte als andere Gruppen.Wenn wir die Ergebnisse zusammenfassen, könnten wir eine kühne Spekulation anstellen, dass aufgrund der Tatsache, dass mehr PTX-beladene (R + D)-Lip in Tumoren abgegeben werden könnten, das Ergebnis der Tumorbehandlung für PTX-beladene (R + D)-Lip war viel besser als andere Gruppen, was auf eine gewisse Bedeutung für die Tumortherapie hinwies.Daher hat sich (R + D)-Lip als hervorragende dual-funktionalisierte Drug-Delivery-Plattform für die Tumorabgabe erwiesen, insbesondere für αvβ3-Integrin-positive Tumorzellen mit deutlich verbesserter Tumortherapiewirkung.SPC (Sojabohnenlecithin) wurde von Shanghai Taiwei Chemical Company (Shanghai, China) gekauft.Cholesterin wurde von Kelong Chemical Company (Chengdu, China) bezogen.DSPE-PEG2000 und 2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(carboxyfluorescein) (CFPE) wurden von Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA) erworben.DSPE-PEG2000-Mal wurde von Shanghai Advanced Vehicle Technology (AVT) LTD Company (Shanghai, China) erworben.cRGDfK-Cystein-Peptid (Zyklus RGDfK-Cys) und [D]-H6L9-Peptid mit einem terminalen Cystein (LHLLHHLLHHLLHLL-Cys, die unterstrichenen Buchstaben waren D-Aminosäuren) wurden gemäß der Standard-Festphasen-Peptidsynthese von ChinaPeptides Co. Ltd. synthetisiert . (Shanghai, China).1,10-Dioctadecyl-3,3,30,30-tetramethylindotricarbocyaniniodid (DiR) wurde von Biotium gekauft.Lysotracker TM wurde von Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) bezogen.6-Diamidino-2-pheylindol (DAPI) und wurde von Beyotime Institute Biotechnology (Haimen, China) bezogen.Andere Chemikalien und Reagenzien waren von analytischer Qualität.DSPE-PEG2000-RGD und DSPE-PEG2000-[D]-H6L9 wurden gemäß unseren zuvor berichteten Methoden synthetisiert und gereinigt16,31.C26-Zellen (murine Dickdarmkrebszellen) und MCF-7-Zellen () wurden in RPMI-1640-Medium (GIBCO), ergänzt mit 10 % FBS, bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 kultiviert.Zellkulturschalen und -platten aus Kunststoff wurden von Wuxi NEST Biotechnology Co. (Wuxi, China) bezogen.BALB/C-Mäuse, erworben vom Versuchstierzentrum der Universität Sichuan (VR China).Alle Tierversuche wurden gemäß den Grundsätzen der Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und vom Verwaltungsausschuss für Versuchstiere der Universität Sichuan genehmigt.6 Wochen bis 8 Wochen alte Balb/C-Mäuse wurden mit 5 × 10 5 Zellen subkutan in die linke Flanke inokuliert.Für die Bioverteilungsstudie durften die Tumore auf ein durchschnittliches Volumen von 50–100 mm3 (Tumorvolumen = Länge × Breite2 × 0,52) wachsen.Zur Herstellung von [D]-H6L9-verankerten Liposomen (D-Lip) wurden SPC, Cholesterin, DSPE-PEG2000 und DSPE-PEG2000-[D]-H6L9 mit einem molaren Verhältnis von 55:33:6:6 darin gelöst die Mischung aus Chloroform und Methanol.RGD-verankerte Liposomen (R-Lip) wurden mit den obigen Materialien hergestellt, wobei DSPE-PEG2000-[D]-H6L9 durch DSPE-PEG2000-RGD in einem Molverhältnis von 55:33:6:6 ersetzt wurde. [D]-H6L9 und RGD co-modifizierte Liposomen [bezeichnet als (D+R)-Lip] wurden mit SPC, Cholesterin, DSPE-PEG2000-[D]-H6L9 und DSPE-PEG2000-RGD mit einem Molverhältnis von 55:33:6:6 hergestellt: 6. Die PEGylierten Liposomen (PEG-Lip) wurden mit SPC, Cholesterin und DSPE-PEG2000 in einem Molverhältnis von 57:33:10 hergestellt. Die organischen Lösungsmittel wurden durch Rotationsverdampfung entfernt und ein dünner Lipidfilm wurde gebildet und weiter getrocknet über Nacht vakuumieren, um restliche Lösungsmittel zu entfernen.Der Lipidfilm wurde mit einem geeigneten Volumen einer 5%igen Glucoselösung hydratisiert und bei 37°C unter Schütteln für 30 min inkubiert.Die erhaltenen Liposomen wurden weiter dispergiert, indem sie intermittierend mit einem Sonden-Ultraschallgerät beschallt wurden.CFPE, DiR und Paclitaxel (PTX) wurden jeweils zu der Lipidlösung gegeben, um die fluoreszenzmarkierten oder mit Arzneimittel beladenen Liposomen zu bilden.Mittlere Teilchengrößen und Zeta-Potentiale von Liposomen wurden mit dem Instrument Malvern Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments Ltd., UK) gemessen.Die Einschlusseffizienz (EE%) von PTX wurde durch HPLC bestimmt.Um die Serumstabilität von Liposomen zu charakterisieren, wurden Schwankungen der Trübung von Liposomen im Serum überwacht (Thermo Scientific Varioskan Flash, USA).100 &mgr;l Liposomen wurden mit 100 &mgr;l fötalem Rinderserum (FBS) bei 37°C mit leichter Oszillation gemischt und die Trübung wurde zu jedem vorbestimmten Zeitpunkt abgelesen.C26-Zellen wurden mit einer Dichte von 1 × 10 5 Zellen/Vertiefung in Platten mit 6 Vertiefungen gepflanzt und 24 h wachsen gelassen.CFPE-markierte Liposomen wurden in frischem Zellkulturmedium aufgetragen und liposomenfreies Kulturmedium wurde als Kontrolle betrachtet.Zwei Stunden nach der Inkubation bei 37 °C wurden die Zellen dreimal mit kaltem PBS gewaschen und dann trypsinisiert und in 0,4 ml PBS resuspendiert.Die Fluoreszenzintensität der Zellen wurde mit einem Durchflusszytometer (CytomicsTM FC 500, Beckman Coulter, Miami, FL, USA) mit einer Anregungswellenlänge von 495 nm und einer Emissionswellenlänge von 515 nm gemessen.Zehntausend Ereignisse wurden für jede Probe aufgezeichnet.5 × 10 3 C26-Zellen wurden in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen ausgesät.Nach dem Anbringen wurde das Zellkulturmedium evakuiert und Liposomen enthaltendes Medium wurde zu jeder Vertiefung gegeben.Vierundzwanzig Stunden später wurde die Zytotoxizität mit dem MTT-Assay bewertet, wobei die Extinktion bei 570 nm abgelesen wurde.Als Kontrollen wurden unbehandelte Zellen verwendet.Alle Messungen wurden dreifach wiederholt.C26-Zellen wurden auf gelatinebeschichtete Deckgläschen in einer Dichte von 2 × 10 4 Zellen/Vertiefung in einer Platte mit 6 Vertiefungen ausgesät.Vierundzwanzig Stunden später wurden die Zellen mit freiem [D]-H6L9-Peptid oder RGD-Peptid enthaltendem Zellkulturmedium für 1 h behandelt.Dann wurden CFPE-markierte (R + D)-Lip zu Zellkulturmedium gegeben und die Inkubation für weitere 2 h bei 37 °C fortgesetzt.Die Zellen wurden gewaschen und mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, und die Zellkerne wurden mit DAPI für 5 min gefärbt, gefolgt von dreimaligem Waschen mit kaltem PBS.Die Deckgläser wurden mit der Zellseite nach unten montiert und durch konfokale Mikroskopie (FV1000, Olympus, USA) betrachtet.Für subzelluläre Lokalisierungsstudien wurden C26-Zellen auf gelatinebeschichtete Deckgläschen in einer Dichte von 2 × 10 4 Zellen/Vertiefung ausgesät.Nach 24 h wurden die Zellen mit CFPE-markiertem (R + D)-Lip in Zellkulturmedium aufgetragen und für 0,5 h oder 4 h inkubiert.Am Ende der Inkubation wurde Lysotracker-Rot (50 nM) in jede Vertiefung gegeben und 30 Minuten lang inkubiert.Die Zellen wurden dann schnell mit eiskaltem PBS gewaschen und mit 4% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur für 15 min fixiert und die Kerne wurden mit DAPI für 5 min gefärbt und die Zellen wurden zur Visualisierung (FV1000, Olympus, USA) verwendet.C26-Zellen wurden trysinisiert und in 1640-Zellkulturmedium bei einer Dichte von 2 × 10 3 Zellen/100 &mgr;l resuspendiert und zu einer mit 2 % Agarose beschichteten Platte mit 96 Vertiefungen gegeben.Die Bildung von C26-Tumor-Sphäroiden wurde durch ein optisches Mikroskop überwacht.Dann wurden die Sphäroide mit CFPE-markierten Liposomen für 2 h inkubiert, vorsichtig mit kaltem PBS durch Pipettieren gewaschen und in 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur fixiert.Fluoreszenzbilder wurden unter einem konfokalen Mikroskop (FV1000, Olympus, USA) aufgenommen.C26-Tumor-tragende Balb/C-Mäuse wurden zufällig in verschiedene Gruppen mit jeweils 3 Mäusen eingeteilt.Für die In-vivo- und Ex-vivo-Bildgebung wurden DiR-beladene Liposomen in einer Dosis von 200 &mgr;g DiR/kg intravenös injiziert.Vierundzwanzig Stunden nach der Injektion wurden die Mäuse mit dem IVI ® Spectrum-System (Caliper, Hopkington, MA, USA) abgebildet.Dann wurden die Mäuse, die mit zervikaler Dislokation hingerichtet wurden, und lebenswichtige Organe und Gewebe (einschließlich Herz, Leber, Milz, Lunge, Nieren und Tumore) herausgenommen und ebenfalls abgebildet.Für die Kryoschnitt-Beobachtung wurden Mäusen DiD-markierte Liposomen injiziert.Vierundzwanzig Stunden später wurden die Mäuse mit Herzperfusion von Kochsalzlösung getötet.Die Tumore wurden geerntet und bei einer Dicke von 10 μm kryogeschnitten, und die Schnitte wurden mit 4% Paraformaldehyd und DAPI behandelt und unter einem konfokalen Mikroskop abgebildet.Die Behandlung begann am 5. Tag der Tumorinokulation und die Mäuse wurden in 6 Gruppen (n = 6) eingeteilt und mit den folgenden sechs Präparaten behandelt: PBS, PTX-Lösung (Taxol), PEG-Lip/PTX, D-Lip/PTX, R-Lippe/PTX und (D + R)-Lippe/PTX.Alle Präparate wurden alle 3 Tage 6 Mal durch die Schwanzvenen injiziert, und die Tumorvolumina wurden überwacht.PTX wurde in einer Dosis von 2 mg/kg verabreicht.Die Tumore wurden danach präpariert und in 4 % Paraformaldehyd getaucht.Dann wurden Tumore in Abschnitte von 5 μm geschnitten und mit CD133-Antikörper behandelt, um die Expressionsniveaus des Stammzellmarkers CD133 nachzuweisen.Zitieren dieses Artikels: Zhang, Q. et al.Dual-funktionalisiertes liposomales Abgabesystem für solide Tumore basierend auf RGD und einem pH-responsiven antimikrobiellen Peptid.Wissenschaft.Rep. 6, 19800;doi: 10.1038/srep19800 (2016).Vaupel, P., Kallinowski, F. & Okunieff, P. Blutfluss, Sauerstoff- und Nährstoffversorgung und metabolische Mikroumgebung menschlicher Tumoren: eine Übersicht.Krebsres.49, 6449–6465 (1989).Svastová, E. et al.Hypoxie aktiviert die Fähigkeit der tumorassoziierten Carboanhydrase IX, den extrazellulären pH-Wert anzusäuern.FEBS Lett.577, 439–445 (2004).Tian, ​​L. & Bae, YH Krebs-Nanomedikamente, die auf den extrazellulären pH-Wert von Tumoren abzielen.Kolloide surfen.B Biointerfaces.99, 116–26 (2012).Lee, ES, Na, K. & Bae, YH Super pH-empfindliche multifunktionale polymere Mizelle.Nano Lett.5, 325–329 (2005).ADS CAS PubMedGoogle ScholarToriyabe, N., Hayashi, Y. & Harashima, H. Die Transfektionsaktivität von R8-modifizierten Nanopartikeln und siRNA-Kondensation unter Verwendung von pH-empfindlichem stearyliertem Octahistidin.Biomaterialien 34, 1337–1343 (2013).Wu, H., Zhu, L. & Torchilin, VP pH-empfindliche Poly(histidin)-PEG/DSPE-PEG-Copolymermizellen für die zytosolische Arzneimittelabgabe.Biomaterialien 34, 1213–1222 (2013).Hu, J., Miura, S., Na, K. & Bae, YH pH-responsive und ladungsabgeschirmte kationische Mizelle aus Poly(l-histidin)-block-kurzverzweigtem PEI zur sauren Krebsbehandlung.J-Steuerung.Veröffentlichung 172, 69–76 (2013).Tu, Z., Volk, M., Shah, K., Clerkin, K. & Liang, JF Konstruktion bioaktiver Peptide mit pH-abhängigen Aktivitäten.Peptides 30, 1523–1528 (2009).CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarMakovitzki, A., Fink, A. & Shai, Y. Unterdrückung des menschlichen soliden Tumorwachstums bei Mäusen durch intratumorale und systemische Inokulation von histidinreichen und pH-abhängigen wirtsabwehrähnlichen lytischen Peptiden.Krebsres.69, 3458–3463 (2009).Midoux, P., Kichler, A., Boutin, V., Maurizot, JC & Monsigny, M. Membranpermeabilisierung und effizienter Gentransfer durch ein Peptid, das mehrere Histidine enthält.Biokonjug.Chem.9, 260–267 (1998).Li, L. et al.Design und Charakterisierung eines säureaktivierten antimikrobiellen Peptids.Chem.biol.Medikament Des.75, 127–132 (2010).Zhang, W. et al.Design eines säureaktivierten zellpenetrierenden Peptids zur Abgabe aktiver Moleküle in Krebszellen.Biokonjug.Chem.22, 1410–1415 (2011).Zhao, BXet al.Die Effizienz tumorspezifischer pH-responsiver Peptid-modifizierter polymerer Micellen, die Paclitaxel enthalten.Biomaterialien 33, 2508–2520 (2012).Jiang, T. et al.Doppelfunktionale Liposomen auf der Basis von pH-responsiven zellpenetrierenden Peptiden und Hyaluronsäure für die tumorgerichtete Verabreichung von Antikrebsmedikamenten.Biomaterialien 33, 9246–9258 (2012).Zhang, Q. et al.Ein pH-responsives a-helikales zellpenetrierendes Peptid-vermitteltes liposomales Abgabesystem.Biomaterialien 34, 7980–7993 (2013).Zhang, Q. et al.Gleichzeitige Verabreichung von therapeutischen Antagomiren mit Paclitaxel zur Behandlung von metastasierenden Tumoren durch ein pH-responsives, antimikrobielles Peptid-vermitteltes liposomales Verabreichungssystem.J-Steuerung.Veröffentlichung 197, 208–218 (2015).Zhang, Q. et al.Entwicklung eines antimikrobiellen Peptid-vermittelten liposomalen Abgabesystems: ein neuartiger Ansatz für pH-responsive antimikrobielle Peptide.Drogenabgabe19, 1–8 (2015).Weis, SM & Cheresh, DA Tumorangiogenese: Molekulare Signalwege und therapeutische Ziele.Nat.Med.17, 1359–1370 (2011).Folkman, J. Rolle der Angiogenese bei Tumorwachstum und Metastasierung.Semin.Onk.29, 15–18 (2002).Nat.Biotechnologie.Chem.Chem.Proz.Natl.Akad.Wissenschaft.Erw.DrogenabgabeErw.Erw.Nano Lett.Int.Mol.EUR.Med.Mol.Mol.CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarCAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarMol.CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarInt.CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarCAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarMed.Ann.Chirurg.Onk.CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarNano Lett.Krebsres.Nat.Med.Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenLeider ist für diesen Artikel derzeit kein teilbarer Link verfügbar.